1 基本原理及主要參數(shù)
了解生化分析儀基本參數(shù)的原理，有利于儀器、試劑的正確使用，有助于正確分析和處理測(cè)定數(shù)據(jù)。生化分析儀根據(jù)自動(dòng)化程度分半自動(dòng)和全自動(dòng)，從目前試劑盒供應(yīng)情況來(lái)看，主要的測(cè)定方法為：終點(diǎn)法(包括一點(diǎn)終點(diǎn)法和兩點(diǎn)終點(diǎn)法)、速率法(連續(xù)檢測(cè)法)、速率兩點(diǎn)法(兩點(diǎn)法)，后兩種統(tǒng)稱動(dòng)力學(xué)法。
2 主要參數(shù)設(shè)置的技巧
2．1 方法類型可根據(jù)試劑盒要求或反應(yīng)原理來(lái)設(shè)置。對(duì)于半自動(dòng)生化分析儀終點(diǎn)法只是一點(diǎn)終點(diǎn)法，全自動(dòng)生化儀單試劑選擇一點(diǎn)終點(diǎn)法，而雙試劑選擇兩點(diǎn)終點(diǎn)法。大多數(shù)酶學(xué)測(cè)定使用速率法，尿素氮、肌酐測(cè)定等用兩點(diǎn)法。
2．2 測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定波長(zhǎng)選擇有三個(gè)主要條件：(1)待測(cè)物質(zhì)在該波長(zhǎng)下的光吸收最大。(2)其吸收峰宜較寬而鈍，(3)常見(jiàn)干擾物在該波長(zhǎng)下的光吸收最小。試劑盒說(shuō)明一般已提供波長(zhǎng)參數(shù)。有些儀器波長(zhǎng)選擇受濾光片數(shù)量限制，應(yīng)該就近選擇為原則。
2．3 測(cè)定溫度一般全自動(dòng)生化儀都是37℃ ，而半自動(dòng)生化儀有室溫、25~C、30cc、37~C等，終點(diǎn)法由于反應(yīng)在機(jī)外進(jìn)行，選擇室溫可以減少儀器溫度調(diào)整時(shí)間，提高工作效率，而速率法和兩點(diǎn)法都選擇37℃比較合適。
2．4 樣本體積分?jǐn)?shù)樣品體積分?jǐn)?shù)即樣品體積與反應(yīng)液總體積的比值(sv／TV)。酶活力測(cè)定中，樣品在總體積中的比例應(yīng)在10％以下。一般來(lái)說(shuō)，待測(cè)物質(zhì)在樣品中含量低的、生理波動(dòng)范圍大的，樣品用量較大。如Trinder反應(yīng)測(cè)定血清葡萄糖、膽固醇等，樣品試劑比例多為1：100，測(cè)定血尿酸或高密度脂蛋白膽固醇，常增加為1：50；AIJT和AST的樣品試劑比例多為1：10至1：20。方法靈敏、吸光度高的實(shí)驗(yàn)方法，樣品試劑比例小，如白蛋白BCG法，樣品試劑比例常為1：200。肌酐Jaffe氏法監(jiān)測(cè)時(shí)間短、吸光度值較低，樣品試劑比例多為l：10。一般應(yīng)以試劑說(shuō)明為準(zhǔn)，不宜輕易改動(dòng)。可根據(jù)最終反應(yīng)液的量來(lái)計(jì)算樣本量和試劑量。
2．5 吸液量主要是針對(duì)流動(dòng)比色的全自動(dòng)或半自動(dòng)儀器的參數(shù)，原則是吸人量不得大于或等于反應(yīng)液總體積，否則會(huì)導(dǎo)致吸空形成比色池氣泡，最好留100～200ul的余地。
2．6 延遲時(shí)間延遲時(shí)間(Delay Time)指試劑與樣品混合后到監(jiān)測(cè)開(kāi)始之間的時(shí)間。延遲時(shí)間的選擇取決于被測(cè)物質(zhì)的濃度(酶的活性)大小、反應(yīng)速度的快慢、酶促反應(yīng)的級(jí)數(shù)、樣品中干擾物消除所需的時(shí)間等。比如：CHE活性高僅需20— 30秒，LDH一級(jí)反應(yīng)需30～40秒，AIJT需40～6O秒，AST需60～75秒，CK需90～120秒。半自動(dòng)生化儀上酶活性連續(xù)監(jiān)測(cè)法的延遲時(shí)間設(shè)定，由于只能單份樣品逐一測(cè)定，若延遲時(shí)問(wèn)全部設(shè)置在儀器內(nèi)，每個(gè)延遲時(shí)間加監(jiān)測(cè)時(shí)間至少1分鐘以上，守候時(shí)間較長(zhǎng)。工作量大時(shí)，可以根據(jù)儀器控溫、加樣及讀數(shù)和試劑特點(diǎn)，以及室溫情況，將延遲時(shí)問(wèn)挪一部分到機(jī)外，套式操作，但要確保機(jī)內(nèi)延遲時(shí)間不要進(jìn)入線性反應(yīng)期。兼顧延遲時(shí)間和監(jiān)測(cè)時(shí)間反應(yīng)時(shí)間是有限制的。在速率法和兩點(diǎn)法中，延長(zhǎng)延遲時(shí)間必然縮短線性監(jiān)測(cè)期，減少測(cè)定的線性范圍，也易發(fā)生底物耗盡。
2．7 監(jiān)測(cè)時(shí)間 酶促反應(yīng)延遲期后，在過(guò)量底物的存在下，反應(yīng)速率加快并達(dá)到一個(gè)反應(yīng)速率穩(wěn)定的階段，即酶促反應(yīng)以恒定的速率進(jìn)行，不受底物濃度的影響，這段時(shí)間稱為線性反應(yīng)期或零級(jí)反應(yīng)期，自動(dòng)化生化分析儀的監(jiān)測(cè)時(shí)間即為此期。測(cè)酶的連續(xù)監(jiān)測(cè)法至少90—120s或至少4點(diǎn)(3個(gè)AA)，少于3個(gè)△A不能稱為連續(xù)監(jiān)測(cè)法，因?yàn)椴荒苡?jì)算線性度。監(jiān)測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則容易發(fā)生底物耗盡，可測(cè)范圍變窄。
2．8 標(biāo)準(zhǔn)液濃度終點(diǎn)法和兩點(diǎn)法必須設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)，選擇合格的標(biāo)準(zhǔn)品很重要。有些試劑盒配有標(biāo)準(zhǔn)液，但是部分項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)液定標(biāo)偏差太大，我們使用的是干粉復(fù)合羅氏校準(zhǔn)液，復(fù)溶后分裝冷凍保存，只要復(fù)溶的水質(zhì)保證，避免反復(fù)凍融，校準(zhǔn)的結(jié)果還是很滿意的。注意校準(zhǔn)液靶值獲得的方法學(xué)，方法不同耙值是有差異的，比較典型的是ALP測(cè)定有IFCC和DGKC法，差異比較大，不可簡(jiǎn)單套用。2．9 K值速率法測(cè)定無(wú)需帶標(biāo)準(zhǔn)或做標(biāo)準(zhǔn)曲線，首先確定樣本量和工作試劑量，再根據(jù)被測(cè)物質(zhì)的摩爾消光系數(shù)，就
可按速率法計(jì)算公式計(jì)算出因素K值了。K=TV×10。／(8×SV XL)，TV為反應(yīng)液總體積，sV為樣本體積，L為比色杯光徑(em)，￡為毫摩爾消光系數(shù)，如NADH／NADPH34Onm為6．22，對(duì)硝基苯胺405nm為9．9，5一氨基一2一硝基苯甲酸405rim為9．5，對(duì)硝基酚405nm為10．5，5一硫代一2一硝基苯甲酸405nm為13．3。
2．10 試劑吸光度上下限有的生化儀要求設(shè)置試劑吸光度上下限，主要是用來(lái)監(jiān)測(cè)試劑的質(zhì)量的，但是試劑吸光度上限和下限不是試劑質(zhì)量的唯一指針。因此，一定的校準(zhǔn)頻率和室內(nèi)質(zhì)控是質(zhì)量保證的必需手段。我們?cè)趯?shí)際工作中就遇到酶活力測(cè)定的試劑空白數(shù)據(jù)在規(guī)定限值內(nèi)，但質(zhì)控物測(cè)定結(jié)果連續(xù)偏低，病人結(jié)果因每天標(biāo)本少而難以判斷，最后發(fā)現(xiàn)是試劑質(zhì)量下降。