組織切片伴隨著顯微鏡技術和免疫實驗等的發展而得到廣泛的應用。本文對其中的冰凍切片、石蠟切片、碳蠟切片、超薄切片、塑料切片等幾種常用的實驗方法相關操作步驟進行介紹。
冰凍切片
是免疫組織化學染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優點是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性,尤其是細胞表面抗原更應 采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。
冰凍時,組織中水份易形成冰晶,往往影響抗原定位。一般認為冰晶少而大時,影響較小,冰晶小而多時,對組織結構損害較大,在含水量較多的組織中上述現象更易發生。冰晶的大小與其生長速率成正比,而與成核率(形成速率)成反比,即冰晶形成的數量愈多則愈小,對組織結構影響愈嚴重。因此,應盡量降低冰晶的數量。Fish認為冰凍開始時,冰晶成核率較慢,以后逐漸增加,其臨界溫度為-33。C, 從-30。C降至-43。C之間,成核率急劇增加達1018,然后再減慢。基于上述理論可采取以下措施減少冰晶的形成。
(1)速凍,使組織溫度驟降,縮短從-33。C43。C的時間,減少冰晶的形成。其方法有二:
①干冰-丙酮(酒精)法:將150-200ml丙酮(酒精)裝入小保溫杯內,逐漸加入干冰,直至飽和呈粘稠狀,再加干冰不再昌泡時,溫度可達-70℃C,用一小燒杯(50-100ml)內裝異戊烷約50ml,再將燒杯緩慢置入干冰丙酮(純酒精)飽和液內,至異戊烷溫度達-70℃時即可使用。將組織(大小為1cm×0.8cm×0.5cm)投入異戊烷內速凍30-60s后取出,或置恒冷箱內以備切片,或置-80℃低溫冰箱內貯存。
②液氮法:將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(直徑約2cm),如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織,然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內,當盒底部接觸液氮時 即開始氣化沸騰,此時小盒保持原位切勿浸入液氮中,大約10-20s組織即迅速冰結成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存備用,或置入恒冷箱切片機冰凍切片。
(2)將組織置于20%-30%蔗糖溶液1~3天,利用高滲吸收組織中水分,減少組織含水量。
影響冰凍切片的因素較多,因此,技術難度較大,選擇好的冰凍切片機是保證切片質量的關鍵。目前冰凍切片機有兩類:
①恒慢冰凍切片機(Cryastat):為較理想的冰凍切片機,型號很多,但其基本結構是將切片機置于-30℃C低溫密閉室內,故切片時不受外界溫度和環境影響,可連續切薄片至2-4μm,完全能滿足免疫組織化學標記要求。切片時,低溫室內溫度以-15℃~18℃為宜,溫度過低組織易破碎,抗卷板的位置及角度要適當,載玻片附貼組織切片,切勿上下移動。
②開放式冰凍切片機:包括半導體致冷切片機和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機。切片時暴露空氣中,溫度不易控制,切片技術難度 大,在高溫季節 ,切片更加困難,且切片厚8~15μm,不易連續切片,但其優點是價廉,國內有生產。
冰凍切片后如不染色,必須吹干,貯存低溫冰箱內, 或進行短暫預固定后貯存冰箱保存
石蠟切片
其優點是組織結構保存良好,在病理和回顧性研究中有較大的實用價值,能切連續薄片,組織結構清晰,抗原定位準確。用于免疫組化技術的石蠟切片制備與常規制片略有不同:①脫水、透明等過程應在4℃。C下進行,以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應限于2cm×1.5cm×0.2cm,使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過程中,石蠟應保持在60℃以下,以溶點低的軟蠟最好(即低溫石蠟包埋)。
以上全過程為18-24h,也可在室溫內使用自動脫水機代替。如組織塊小,直徑小于0.5cm,可用快速石蠟包埋切片,全過程只需4h左右。
石蠟切片為常規制片技術,切片機多為輪轉式,切片厚度2~7μm,應用范圍廣,不影響抗體的穿透性,染色均勻一致。由于甲醛固定、有機熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽,使抗原特征發生改變。有人報告經蛋白酶消化,可以改善光鏡免疫組化染色強度,常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應入37℃恒溫箱過夜,這樣烤片可減少染色中脫片現象。切片如需長期貯存,可存放于4℃冰箱內備用。
石蠟切片優點較多,但在制片過程中要經過酒精、二甲苯等有機溶劑處理,組織內抗原活性失去較多,有人采用冷凍干燥包埋法(Freeze drying embedding methed),可以保存組織內可溶性物質,防止蛋白變性和酶的失活,從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組織低溫速凍,利用冷凍干燥機(Freezing dryer)在真空、低溫條件下排除組織內水分 ,然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織,最后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標記、免疫酶標記及放射自顯影。
振動切片
用振動切片機(Vibratotme),可以把新鮮組織(不固定不冰凍)切成厚片20~100μm,以漂浮法在反應板進行免疫組織化學染色,然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應陽性部位,修整組織進行后固定,最后按電鏡樣品制備、脫水、包埋、超薄切片、染色觀察等。組織不冰凍,無冰晶形成和組織抗原破壞,在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害,能較好地保留組織內脂溶性物質和細胞膜抗原,主要用于顯示神經系統抗原分布研究。這種包埋前染色,尤其實用于免疫電鏡觀察。
塑料切片
塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類(Glycol methacrylate, GMA)及環氧樹脂類(Epon 812,618),其優點是可以同時作光鏡和電鏡檢測,能相互對照所查抗原,定位準確。塑料包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片,光鏡切片可薄至0.5~2um,故稱半薄切片(Semithin section)。GMA保存抗原較好,不與組織產生共聚合,但形態學結構欠佳。環氧樹脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態學結構,但在聚合過程中易和組織起作用,改變抗原結構。塑料包埋切片由于處理程序繁多,抗原活性易丟失。同時半薄切片進行免疫染色時,抗血清不易穿透樹脂,因此,塑料切片主要用于免疫電鏡的超微切片前定位。包埋前染色的標本,切片薄切片后不需染色,直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應部位呈黑點狀,定位后進一步作超薄切片,這樣,可以明顯提高免疫電鏡陽性檢出率。
超薄切片
電鏡標本制作,應用超薄切片機(Ultrotome)進行切片。
碳蠟切片
碳蠟(Carbowax),學名聚乙烯二醇(Polyethlene glycol, PEG)為水溶性蠟。根據其分子量不同,碳蠟有多種,如400、800、1000、1500、4000、6000等,用于組織包埋的有1500、4000兩種,其熔點分別38℃C和52。C左右,常溫下為固體石蠟狀,加溫熔化呈液體狀。
本法的特點是組織固定水洗后,不需脫水透明可直接浸蠟包埋,且切片方法與常規石蠟切片相同。切下的組織片漂浮水面后自然展開,碳虹迅速深化,組織片即可展平,制片過程簡單易行。
具體操作簡述如下:組織塊不宜過大,一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內。①組織固定后充分水洗去除固定液,用濾紙吸干組織表面水。②將組織浸入碳蠟(1500)內,45℃30min。③再次浸入混合混合碳蠟液(1500和4000等量混合液),52℃ 30min。④浸入等量混合碳蠟液(或根據氣溫、濕度變化調整4000和5000混合比例,如氣溫高濕度大可以4000:1500=3:2混合,反之,則2:3混合)。⑤用等量混合碳蠟或調整混合碳蠟包埋成組織蠟塊。⑥切片與石蠟切片相同。在操作過程中,碳蠟組織塊應盡量避免與水或冰接觸,貯存時應密封干燥冷藏。
本法優點是操作程序減少,時間縮短,組織不經有機溶劑損害、溫度低、抗原性保存比石蠟切片好,組織結構清晰。缺點是夏季室溫高時切片較困難,連續切片不如石蠟切片順利;由于碳蠟有強吸濕性,不易長期保存。
從上文我們可看到,各種的組織切片方法的優點和不足各不同,例如冰凍切片法能較好地保存抗原的活性但實驗要求高,而石蠟法則在保存組織結構完整性上表現出色但活性保存度低,而碳蠟法操作簡單但不易保存。